免疫学的測定法(イムノアッセイ)

免疫学的測定法(イムノアッセイ)

免疫反応を利用して物質を分析する方法として、免疫学的測定法(イムノアッセイ)がある。イムノアッセイは、抗体に抗原を認識させる(抗原抗体反応を利用する)ことにより、物質を定量する分析法であり、多成分一斉解析には不向きであるが、高感度な測定が可能である。また、合成医薬品やステロイドホルモンなどの低分子からタンパク質や核酸などの高分子までさまざまな物質の定量に用いられている。

1 抗体

1)抗体の構造と機能 

 抗体は、免疫グロブリンといわれる一群のタンパク質であり、主に5つのクラスに分類(IgM、IgG、IgA、IgD、IgE)されており、その中でもイムノアッセイでは、主にIgGが用いられる。
IgGの構造を以下に示す。

IgGは、2本の重鎖(H鎖)と2本の軽鎖(L鎖)で構成されており、これらはジスルフィド結合で連結されている。H鎖とL鎖はそれぞれ定常部(C領域)、可変部(V領域)に区分される。
抗体は、化学構造上の微妙な違い(官能基の位置、立体配置、種類)を認識し、抗原と特異的に結合する。抗体と抗原が結合する際には、可変部を構成するアミノ酸の一部が特定の抗原との間に相互作用(水素結合、静電力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用など)が働く。

<参考:低分子の測定>
特異抗体と結合はするが、免疫反応を起こすことができない低分子をハプテンという。ハプテンに免疫原性を持たせるためには、タンパク質などの高分子と結合させる必要がある。このことから、低分子を免疫測定法により測定するためには、タンパク質などの高分子と結合させる必要がある。

2)抗体の調製

 イムノアッセイを行うに当たって、適切な抗体を調製する必要がある。イムノアッセイで用いる抗体の調製法を以下に示す。

例)抗原に抗原決定基Ⅰ、Ⅱを有する場合

この方法により、得られた抗血清中の抗体は、抗原決定基Ⅰ、Ⅱに結合する抗体の混合物であるため、ポリクローナル抗体とよばれる。ポリクローナル抗体は、多くの抗原決定基を認識するため、特定の物質の定量には不向きである。そこで、現在では、細胞融合法により、特定の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体を調製している。細胞融合法では、免疫反応させた形質細胞にミエローマ細胞(形質細胞を腫瘍化した細胞)を融合させ、ハイブリドーマ(抗体産生能と増殖能を併せもつ雑種細胞)を作製する。作成したハイブリドーマを、いったん単一のクローンに分離したのち大量に培養すると、モノクローナル抗体を調製することができる。

<参考:交差反応>
 交差反応とは、抗体が目的抗原と類似する物質と反応することであり、反応特異性の高いモノクローナル抗体でも、交差反応は認められる。

2 イムノアッセイの分類

イムノアッセイは、抗原抗体反応の様式、B /F分離の有無、標識の有無、標識の種類により分類される。

1)競合法の原理

競合法では、一定量の抗体に対して、一定量の標識抗原(何らかのシグナルを発する物質を抗原に結合させたもの)と非標識抗原を競合的に反応させる。以下に競合法の概要を示す。

・手順1
標識抗原のみと反応させたときに、その総量の50%程度と結合する抗体を用意する。

・手順2
手順1で準備したものに、段階的に量を変化させた非標識抗原の添加する。

手順1、2で調製したものをB/F分離し、その後、B画分のシグナル強度を測定する。

・手順3
手順1、2で得られたシグナル強度をもとにB/B0(B画分のシグナル/非標識抗原0のときのB画分のシグナル)を算出し、非標識抗原の添加量の対数値に対してプロットすると、標準曲線が得られる。

・手順4
抗原の含量が不明な試料(定量したい試料)を手順1で調製したものに添加し、B/B0を算出する。その値から標準曲線を用いて、試料に含まれる抗原の量を算出する。

2)非競合法の原理

非競合法では、測定対象の抗原に過剰量の標識抗体を反応させて、形成される免疫複合体の量を標識シグナル強度から求める。以下に非競合法のひとつであるサンドイッチアッセイの概要を示す。

・手順1
一定過剰量の抗体(Ab1)を固定化した固相に、目的抗原を添加し補足させる。

・手順2
手順1で調整したものに、過量の標識抗体(Ab2)を添加する。

・手順3
固相を洗浄して未反応の標識抗体(Ab2)を除去したあと(B/F分離したあと)、固相上に残存する標識が発するシグナルを測定する。

・手順4
手順3で得られたシグナル強度を目的抗原の添加量の対数値に対してプロットすると、標準曲線が得られる。

・手順5
抗原の含量が不明な試料(定量したい試料)を一定過剰量の抗体(Ab1)を固定化した固相に添加し、シグナル強度を測定する。その値から標準曲線を用いて、試料に含まれる抗原の量を算出する。

3 不均一系イムノアッセイ

B画分とF画分の分離を行った後、シグナル強度を測定する方法を不均一系イムノアッセイという。不均一系イムノアッセイでは、B/F分離を行うため、操作が煩雑になるが、高い感度を得やすいため、広く利用されている。

1)競合法に基づく不均一系イムノアッセイ

競合法に基づく不均一系イムノアッセイには、放射性同位元素で標識した抗原を用いるラジオイムノアッセイ(RIA)や酵素で標識した抗原を用いるエンザイムイムノアッセイ(EIA)がある。また、蛍光物質、発光物質で標識する蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイがある。

・ELISA
エンザイムイムノアッセイ(EIA)の中には、抗体(抗原)をマイクロプレートに固定して行うELISA(イライザ、エリザ)といわれる方法がある。ELISAについては、プレート専用の洗浄装置があり、多くの試料を簡便にかつ迅速に分析することが可能であるため、臨床検査や基礎研究で幅広く利用されている。

 2)非競合法に基づく不均一系イムノアッセイ

非競合法に基づく不均一系イムノアッセイには、放射性同位体標識抗体を用いる2部位イムノラジオメトリックアッセイ(別名:サンドイッチラジオイムノアッセイ)や酵素標識抗体を用いる2部位イムノエンザイモメトリックアッセイ(別名:サンドイッチエンザイムイムノアッセイ)がある。

4 均一系イムノアッセイ

B画分をF画分を分離せず、シグナル強度を測定する方法を均一系イムノアッセイという。均一系イムノアッセイでは、B/F分離を行わないため、不均一系に比べて感度は劣るが、操作が簡便で迅速性に優れている。均一系イムノアッセイは、血中薬物モニタリング(TDM)における血中薬物の測定などに利用されている。均一系イムノアッセイには、ホモジニアスエンザイムイムノアッセイ(EMIT)や蛍光偏光イムノアッセイ(FPIA)などがある。

・ホモジニアスエンザイムイムノアッセイ(EMIT)
酵素で標識したハプテンに抗体が結合すると酵素活性が変化(阻害または活性化)することがある。このことを利用して、免疫測定法を行う方法をEMITという。

・蛍光偏光イムノアッセイ(FPIA)
 蛍光物質に平面偏光を照射し励起させると、蛍光物質が励起され、放出される蛍光も平面偏光となる。

低分子量の蛍光物質で標識したハプテンは、ブラウン運動しており、放出される平面偏光があらゆる方向を示すようになるため、蛍光の偏光度が小さくなる(偏光が解消される)。それに対して、低分子量の蛍光物質で標識したハプテンに抗ハプテン抗体を結合した質量が大きな複合体では、ブラウン運動による偏光の解消が起こりにくくなる。

蛍光偏光イムノアッセイでは、低分子量の蛍光物質で標識したハプテンに抗ハプテン抗体が結合しているものを準備しておき、そこに非標識ハプテンを添加することにより、非標識ハプテンの量を求めることができる。

5 非標識イムノアッセイ

標識イムノアッセイでは、放射性同位元素や酵素、蛍光物質等で標識された抗原や抗体が用いられるが、非標識イムノアッセイでは、抗原や抗体のいずれも標識することなく、免疫複合体の生成量を直接測定する。非標識イムノアッセイの代表例として、ネフェロメトリックイムノアッセイ(免疫比濁法)がある。

・ネフェロメトリックイムノアッセイ(免疫比濁法)
 ハプテン−タンパク質結合体をラッテックス表面にコーティングした人工多価抗原に抗ハプテン抗体を添加すると、抗ハプテン抗体が人工多価抗原の間に架橋を形成し、ラテックスが凝集し、コロイド状の懸濁液となる。この懸濁液にレーザーを照射すると、チンダル現象により散乱光が認められる。この状態に遊離ハプテンを含む試料を添加すると、ラテックスの凝集は競合的に抑制され、散乱光の強度が低下する。この散乱光の強度の低下より試料に含まれるハプテン量を求める。

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関連問題
第97回 問202〜203
第99回 問202〜203
第102回 問198〜199
第104回 問196〜197